摘要：目的了解登封市2013年小肠结肠炎耶尔森菌生物学特性及宿主分布特征。方法用传统培养方法分离小肠结肠炎耶尔森菌，并进行生化鉴定、血清分型和毒力基因PCR检测。结果2013年采集标本共1138份，分离出小肠结肠炎耶尔森菌169株，总检出率为14.85%；其中猪标本检出率高达36.55%（114/394）；生物型3型占86.39%（146/169），均为O∶3血清型；毒力基因ail＋、ystA＋、yadA＋、virF＋占81.06%（137/169），ail＋、ystA＋占5.33%（9/169），ystB＋占12.43%（21/169），ail－、ystA－、ystB－、yadA－、virF－占1.18%（2/169）。结论猪是小肠结肠炎耶尔森菌的优势宿主；小肠结肠炎耶尔森菌的血清型以O∶3型为主。
关键词：小肠结肠炎耶尔森菌；毒力基因；生物分型；登封市小肠结肠炎
耶尔森菌（Yersiniaenterocolitica）是一种人兽共患性、食源性病原菌，可在冷藏温度下生长，广泛存在于自然界各种动物宿主［1-2］，包括家畜、家禽、啮齿动物、爬行动物和水生动物等，其中猪、犬、牛等宿主与人群感染有重要关系，其可引起胃肠道症状、呼吸系统、心血管系统和骨骼结缔组织等局部组织或全身性疾患［3］。20世纪80年代中期，兰州［4］和沈阳市发生小肠结肠炎耶尔森菌流行，感染病例达500例，引起高度关注。2013年登封市扩大对腹泻患者、家畜和家禽等监测范围，尤其是对屠宰场猪咽拭子、肛内容物及食品等监测范围。对分离出的小肠结肠炎耶尔森菌进行生物化学鉴定、血清学分型及PCR扩增毒力基因等，了解小肠结肠炎耶尔森菌的生物学特性及宿主分布特征，为预防控制小肠结肠炎耶尔森菌感染提供科学依据。
1材料与方法
1.1样本来源
2013年在登封市共采集各类标本1138份。其中，在腹泻监测点采集腹泻患者粪便569份；在各乡镇采集家畜、家禽粪便标本32份；在定点生猪屠宰场，用已消毒的棉拭子（特制加长）采集刚屠宰后生猪咽拭子及肛内容物394份；采集市场待售肉制品143份。
1.2试剂及仪器
小肠结肠炎耶尔森菌选择性培养基和配套抗生素为美国BD公司产品，0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH7.4，改良PBS）、克氏双糖铁琼脂（KIA）、动力吲哚尿素培养基（MIU）均购自上海市疾病预防控制中心（CDC），哥伦比亚营养琼脂购自英国Oxoid公司。小肠结肠炎耶尔森菌分型血清购自日本生研株式会社（包括O∶1、O∶2、O∶3、O∶5、O∶8和O∶9型），菌株鉴定用的API20E生化板条及配套试剂均购自法国生物梅里埃公司，PCR扩增相关试剂及引物合成来自生工生物工程（上海）股份有限公司。PCR热循环仪、电泳仪、琼脂糖凝胶电泳成像仪均为美国Bio⁃Bad公司产品。PCR扩增用Premix、2000bpDNALadder（DL2000）均购自TaKaRa公司。
1.3菌株的分离培养
将采集标本于4℃冷增菌培养，分别于7、14、21d后转种于小肠结肠炎耶尔森菌选择性培养基，25℃培养24～36h，挑取疑似菌落转种于克氏双糖斜面25℃培养24h，选择克氏双糖+/+、不产气、H2S-，接种于尿素培养基及半固体培养基，选择尿素酶+、25℃培养动力+、37℃培养动力-，镜检为革兰阴性杆菌或椭圆或球杆菌细菌，使用API20E肠道菌生化鉴定板条进行菌种鉴定［5-7］。
1.4生物分型及血清分型
生化反应是小肠结肠炎耶尔森菌鉴定的主要依据，同时将检测结果作为生物分型的依据。具体参照文献［3］进行。对鉴定结果为小肠结肠炎耶尔森菌的菌株参照文献［8］进行血清学分型，设盐水对照。1.5PCR检测借助PCR检测技术对小肠结肠炎耶尔森菌黏附侵袭点基因（ail）、耐热性肠毒素基因（ystA）、生物1A型携带的肠毒素基因（ystB）、黏附素（yadA）、yop调节子转录活化作用因子（virF）等进行检测。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离（170V，30min），引物序列参照文献［9］进行。携带ail＋、ystA＋、yadA＋、virF＋、ail＋或ystA＋等基因的菌株为致病性菌株，携带ystB＋、ail－、ystA－、ystB－、yadA－、virF－基因的菌株为非致病性菌株。
2结果
2.1标本检出情况
2013年采集人、动物宿主粪便、猪咽拭子、猪肛拭子及食品标本共1138份，小肠结肠炎耶尔森菌总检出率为14.85%（169/1138）。腹泻患者、犬、鸡粪便的小肠结肠炎耶尔森菌检出率分别为0.70%（4/569）、50.00%（2/4）和13.33%（2/15）；猪咽拭子及肛内容物小肠结肠炎耶尔森菌的检出率为36.55%（144/394）。食品样品的小肠结肠炎耶尔森菌检出率为11.89%（17/143）。
2.2生物分型及血清学分型结果
169株小肠结肠炎耶尔森菌经API20E生化鉴定板条鉴定，1A生物型占13.61%（23/169），3型生物型占86.39%（146/169）；因血清类型有限，10株菌未进行定型（5.92%），O∶3血清型占86.39%（146/169），O∶5血清型占7.69%（13/169），见表1．
2.3毒力基因检测情况
对169株菌株ail、ystA、ystB、yadA和virF5种毒力基因进行检测，ail＋、ystA＋、yadA＋、virF＋占81.06%（137/169），ail＋、ystA＋占5.33%（9/169），ystB＋占12.43%（21/169），ail－、ystA－、ystB－、yadA－、virF－占1.18%（2/169）。
3讨论
小肠结肠炎耶尔森菌的暴发流行显示均与食物相关［4］。小肠结肠炎耶尔森菌的致病性与分布在染色体和70kb质粒编码的毒力因子有关，且需两因子共同作用使其进入下层淋巴组织定殖，发挥致病作用［10］。PCR扩增的5种毒力基因有ail、ystA、ystB、yadA、virF等，根据毒力基因携带情况将小肠结肠炎耶尔森菌分为致病性菌株及非致病性菌株。2013年登封市分离小肠结肠炎耶尔森菌阳性菌株169株，其致病性菌株（ail＋、ystA＋、yadA＋、virF＋、ystA＋）占86.39%（146/169），非致病性菌株（ystB＋、ail－、ystA－、ystB－、yadA－、virF－）占13.61%（23/169），原因为在本年度的监测中，猪体内的小肠结肠炎耶尔森菌检出率较高，且均为致病性菌株。说明猪是该菌的优势宿主，且其体内携带的小肠结肠炎耶尔森菌大部分为致病性菌株，该结果与以往研究结果一致［7］。小肠结肠炎耶尔森菌血清型较多，我国报道的血清型达58个［11］，以O∶3、O∶5、O∶8和O∶9型菌株为主。近年来，O∶3型菌株的流行呈上升趋势［12］。本次监测的宿主以O∶3血清型为主，占86.39%（146/169）。李洪民等［5］调查显示，O∶3、O∶5血上清型均占13.48%（12株），O∶8占15.73%（14株）。2011年登封市小肠结肠炎耶尔森菌以O∶3血清型为主，占81.87%（289株）［6］，与本调查结果一致。小肠结肠炎耶尔森菌在自然界分布广泛，包括所有的家畜、家禽和啮齿类动物等。故登封市在以往的监测基础上，应继续开展家畜、家禽、患者及重点宿主的带菌状况调查。本次调查家畜猪体内的小肠结肠炎耶尔森菌检出率高达36.55%，与相关报道一致［9，13］。该结果对以后的小肠结肠炎耶尔森菌疫情防控有重要的科学指导意义，应加强小肠结肠炎耶尔森菌流行知识的宣传，尤其加强对猪的养殖者指导。志谢中国CDC传染病预防控制所景怀琦研究员及其团队在课题完成过程中给予帮助。
作者：张胜勇 李洪民 王德祥 张锦 夏胜利 单位：登封市卫生防疫站 河南省疾病预防控制中心