摘要:目的分析一起学校诺如病毒感染性腹泻疫情流行病学特征及其感染病毒基因型别，探讨可能传播途径，为有效控制疫情提供科学依据，同时为类似疫情现场处置提供经验。方法制定统一病例定义，在全校学生及教职员工中开展主动病例搜索，采用描述性流行病学和回顾性队列研究进行分析;采集未经治疗发病学生呕吐物、粪便或肛拭子，食堂员工及食堂环境样本，发病班级饮用水及环境拭子，运用实时荧光ＲT－PCＲ进行诺如病毒核酸检测，阳性样本进行ＲT－PCＲ，PCＲ产物纯化、测序，序列经核酸比对确认，应用ClustalX、MEGA5.1等软件分析基因序列，构建系统进化树;采用Excel2010软件建立数据库，OpenEpi3.03在线软件进行统计学分析。结果2014年11月18－24日，该校共报告病例36例，19日为发病高峰(19例)。病例集中分布在二(3)班，罹患率为55.81%(24/43)，其次为二(10)班，罹患率为14.29%(6/42);症状以呕吐为主(97.22%)，发热(38.89%)、腹痛(36.11%)及腹泻(8.33%)。回归性队列研究显示参加舞蹈兴趣班为发病危险因素(ＲＲ=6.67，P＜0.01)。经实时荧光ＲT－PCＲ检测，16份发病学生样本中诺如病毒核酸阳性6份。序列比对结果显示，Jinshan06、Jinshan09等6株基因同源性为100%，其与GII.P17_GII.17/Kawasaki323、GII.17/Oki-nawa/FP027/2012等株基因同源性高达98%，均属GⅡ.17型诺如病毒，指示病毒同源。结论本次疫情是一起因密切接触引起GⅡ.17型诺如病毒感染性腹泻疫情。
关键词:诺如病毒;急性胃肠炎;暴发;流行病学;学校
诺如病毒(norovirus，NoV)又称为诺瓦克病毒(norwalkviruses，NV)，是人类杯状病毒科(humancali-civirus，HuCV)中诺如病毒属的原型代表株。该病毒具有发病急、感染剂量低、传播途径广泛、人群缺乏持久免疫力且普遍易感等特点，是引起人类非细菌性急性胃肠炎暴发和散发的重要病原，极易在幼儿园、学校、养老院等聚集场所引起暴发［1］。2006－2013年国内诺如病毒感染导致突发公共卫生事件呈上升趋势，累计报告56起，发病4979例，极大危害公众身心健康［2］;同样上海市感染性腹泻监测结果显示，腹泻患者中诺如病毒检出率高达26.17%，诺如病毒已成为上海市腹泻患者感染最主要病原体［3］。2014年11月20日，上海市金山区某学校发生一起聚集性呕吐、腹泻病例疫情，为掌握其流行病学和感染的病原学特征，探寻感染来源和传播的危险因素，提出针对性防控措施，预防类似事件的发生，开展本次调查。
1对象与方法
1.1病例定义
1.1.1疑似病例2014年11月15－26日，在该学校的全体学生及教职员工中出现有呕吐症状者或腹泻次数≥3次/d或者腹泻次数＜3次/d，并伴有腹痛、恶心主观症状之一者。1.1.2确诊病例疑似病例中呕吐物、腹泻物或肛拭子样本中至少1项实时荧光ＲT－PCＲ诺如病毒核酸检测阳性者。1.2病例搜索根据病例定义通过查阅学校卫生室就诊记录、学校因病缺勤缺课登记记录进行病例搜索，并采用面对面访谈及电话调查方式开展个案调查，内容包括病例基本情况、发病情况、临床特征、发病前3d饮食饮水史及流行病学接触史等。
1.3卫生学调查
对学校内供水、食堂设施、卫生状况、食品加工过程和食堂员工饮食饮水情况进行调查。
1.4实验室检测
1.4.1样本采集随机采集发病学生的呕吐物样本2份、粪便3份及肛拭子样本11份;采集4份食堂员工肛拭子及3份食堂内环境样本;采集3份发病班级桶装水及4份班级内环境样本。病毒管4℃保存、送检。1.4.2ＲNA提取及cDNA合成使用QIAampViralＲNAMiniKit试剂盒从采集样本中提取病毒核酸，操作方法见试剂说明书;采用SuperScriptTMⅢFirstSynthesisSystemfotＲT－PCＲ试剂盒，按照其操作说明书利用所提取的病毒核酸合成cDNA。反转录条件:25℃预热10min，50℃作用50min，85℃灭火5min，再加入M－MLV反转录酶1μl，37℃作用20min。产物置于－20℃存贮备用。1.4.3实时荧光ＲT－PCＲ利用上述提取ＲNA样本，按照荧光ＲT－PCＲ测定试剂盒操作说明书(上海之江生物科技有限公司)对其进行诺如病毒核酸检测，以明确患者诺如病毒感染。反应体系25μl:NoV荧光PCＲ检测混合液18μl、逆转录酶1μl、无ＲNA酶水1μl、ＲNA5μl。扩增条件:45℃，逆转录反应10min;95℃，预变性15min;95℃变性15s，60℃退火1min，共40个循环。判断标准:以Ct值≤30为结果阳性;30＜Ct值＞40为检测灰区，需复检1次，Ct值仍小于40可判断为阴性;Ct值无任何数值判为阴性。1.4.4常规ＲT－PCＲ应用引物对COG2F和GⅡSKＲ扩增诺如病毒衣壳蛋白基因区(Capsid)N/S端，PCＲ产物大小为387bp，PCＲ产物经质量分数为1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。1.4.5DNA纯化、测序和序列分析利用TaKaＲaAgaroseGelDNAPurificationKit试剂盒，按照其操作说明书对PCＲ产物进行纯化回收，PCＲ产物委托上海生工生物技术公司进行双向测序;测得序列经核酸比对程序(www.nvbi.nlm.nih.gov)比对确认，利用Clust-alX、MEGA5.1等软件进行序列分析，构建系统进化树。
1.5统计学分析
采用Excel2010软件建立数据库，并进行流行病学特征分析;运用OpenEpi3.03在线软件进行数据分析，计算ＲＲ值及其95%可信区间，并进行连续校正χ2检验，检验水准α=0.05。
2结果
2.1基本情况
该学校有2栋楼，1栋为5层教学楼，1栋为行政办公楼;仅设置一、二个年级19个班级，学生835人，教职工53人。校内设有食堂，从业人员12名，食物统一制作，仅供应在校师生午餐。2014年11月15－26日该校共报告病例36例，病例集中报告于二(3)班，罹患率为55.81%(24/43);此外二(10)班、二(5)班、二(4)班等其它6个班级也有相似症状病例报告，校内教职员工无相似症状病例报告。所有病例均为轻症，无重症病例、死亡病例。
2.2流行病学特征
2.2.1首发病例调查首发病例8岁男性，二(3)班学生。该病例发病前1d(17日17时)有某小龙虾馆就餐史，期间食用盱眙麻辣小龙虾，白灼小龙虾及蛤蜊炖蛋;18日凌晨4点呕吐2次，期间无发热、腹泻及腹痛等症状，18日当日继续上课，并参与班级内集体活动。19日早上7时，患者腹部有不适症状，医院给予胃肠炎对症治疗。2.2.2时间分布首发病例11月18日4时发病，19日发病19例达到发病高峰、20日发病7例、21日发病3例、23日发病1例及24日发病4例，25日及以后再无新发病例报告。此次疫情持续6d，见图1。2.2.3性别、年龄分布报告的36例病例中男性、女性各发病18例;7岁者1例，8～9岁者35例。病例较多的二(3)班男、女发病各12例，男性罹患率和女性罹患率分别为57.14%和54.55%，两者之间差异无统计学意义(ＲＲ=1.30，95%CI:0.62～1.78)。2.2.4班级分布病例分布在7个班级，其中二(3)班共计发病24例，二(10)班发病6例，二(8)班发病2例、二(5)班、二(4)班、二(1)班及一(9)班各发病1例。二(3)班罹患率(55.81%)显著高于其他发病班级(4.71%)(ＲＲ=11.86，95%CI:6.43～21.89)。
2.3临床症状
所有病例急性起病，症状均为轻型，以呕吐为主，少数伴有腹痛、腹泻症状。其中呕吐者占97.22%(35/36)，多数在为1～6次/d;发热者38.89%(14/36)、腹痛者36.11%(13/36)、恶心者30.56%(11/36)及腹泻者8.33%(3/36)，见表1。患者病程为1～3d，中位数为2d。
2.4危险因素调查
2.4.1饮食情况校内有食堂，仅提供学生与教职工午餐，统一制作。食堂负责每天食品原料采购，加工后统一分装餐盒送至教室供学生用餐，餐具统一清洗、消毒处理，卫生情况良好;食堂从业人员均持有健康证。调查所有病例发病前3d就餐史，学生仅有发病前1d(周一)共同食物就餐史，但学生食用相同种类午餐，未发现有可疑食物进食史。2.4.2饮水情况学生及教职工饮用过同一品牌、同一批次桶装水，教职工及其他班级学生无发病情况;二(3)班发病学生日常饮水类型不同，但相比该班发病学生饮用开水罹患率(53.85%)，饮用温水罹患率(57.89%)及凉水罹患率(54.55%)，差异均无统计学意义(χ2=0.43、0.51，P＞0.05);实验室检测桶装水符合饮用水标准。2.4.3日常接触情况二(3)班发病学生未能及时隔离，仍在正常上课;疫情发生前2d该班均有集体性活动课，且该班级11名学生参加校内每日两次舞蹈兴趣课。舞蹈兴趣课:二年级10个班级共37人参加每日两次校内舞蹈课，二(3)班发病5例、二(10)班发病3例及二(4)班发病1例;舞蹈兴趣课内男女性罹患率(20.00%、19.05%)，差异无统计学意义(χ2=0.46，P＞0.05);参加舞蹈兴趣课学生发病风险为未参加的6.67倍(ＲＲ=1.05，95%CI:1.67～26.57)，见表2．
2.5实验室检测
2.5.1实时荧光ＲT－PCＲ采集发病学生(粪便、肛拭子及呕吐物)、食堂员工、发病班级(门把手、扶梯等)及食堂(餐具、砧板等)环节样本及发病班级桶装水。实验室检测结果证实发病学生中1份呕吐物、3份粪便及4份肛拭子样本检出GⅡ型诺如病毒核酸，其它采样样本诺如病毒核酸均为阴性。2.5.2诺如病毒Capsid的N/S区遗传进化分析在诺如病毒Capsid的N/S区，jinshan06/2014/shang-hai/CHN、jinshan06/2014/shanghai/CHN等6株与GII/JP/2014/GII.P17_GII.17/Kawasaki323、NoV/Hu/GII.17/Okinawa/FP027/2012等株在进化树的同一分支上，可信度为98%，基因型为GⅡ.17型诺如病毒，见图2。
讨论
根据本起疫情流行病学调查、临床症状及实验室分析结果，确定该疫情是一起因密切接触由GⅡ.17型诺如病毒感染引起学校感染性腹泻疫情。GⅡ.17型诺如病毒感染引起暴发或散发疫情鲜见报告，美国2009－2013年间仅有4起GⅡ.17型诺如病毒暴发报道［4］，前期也仅在韩国、日本等散发急性胃肠炎患者及肯尼亚河水中检出GⅡ.17型诺如病毒［5－6］，但近期相关研究证实GⅡ.17型诺如病毒导致大量感染性腹泻疫情的暴发［7－8］，GⅡ.17型诺如病毒已成优势病毒株。食源性传播是诺如病毒重要传播途径［9］，美国2009－2010年间报告实验室确诊790起食源性疾病暴发中诺如病毒感染引起占42%［4］，且有隐性携带病毒食堂员工污染食物导致诺如病毒感染性腹泻暴发报道［11］。本次疫情流行病学调查分析显示食源性传播意义不大，学校所有学生食用同一种类午餐，未发现有可疑食物进食史，且食堂员工及食堂内环境均未检出诺如病毒。水源性传播在诺如病毒暴发中起着重要作用，浙江省2004－2014年16起诺如病毒感染性暴发疫情中14起因饮用水污染引起［12］;本次疫情学生及教职工饮用过同一品牌、同一批次桶装水，发病学生日常饮水类型罹患率差异也无统计学意义，但病例集中在二(3)班，且实验室检测桶装水符合饮用水标准，排除桶装水污染导致暴发可能。密切接触也是导致诺如病毒暴发主要原因［13］。美国诺如病毒监测网络显示，2009年8月－2013年9月共报告2895起明确传播途径的诺如病毒感染性腹泻疫情，密切接触传播导致暴发疫情占83.7%(2425/2895)，密切接触为美国诺如病毒感染性腹泻暴发最主要原因［14］。本起疫情中发病学生未能及时隔离，患者参与班内集体性活动及校内舞蹈兴趣课，通过回顾性队列研究进一步证实学生间密切接触为本起疫情发生危险因素，并且不同班级发病学生所感染诺如病毒核苷酸同源性达100%，指示病毒同源，密切接触导致本起学校诺如病毒感染性腹泻疫情暴发。综上所述，本次学校疫情因密切接触导致GⅡ.17型诺如病毒感染性腹泻疫情。通过加强学校晨检及课间巡查，做到早发现、早隔离，暂停校内一切集体性活动及实施校内全面消毒等综合防控措施，及时控制疫情，维护师生身心健康。
作者：宋灿磊 刘天 杜荐如 朱建明 单位：上海市金山区疾病预防控制中心