１细胞增殖能力的检测
实验设ＨＯ８９１０组、ＮＣ－ｓｈＲＮＡＨＯ８９１０组和ＬＡＩＲ－１－ｓｈＲＮＡＨＯ８９１０组，分别收集处于对数期生长的各组细胞。用不含双抗的１０％ＦＢＳ－ＲＰＭＩ１６４０培养基重悬细胞，并调整密度为２×１０４／ｍｌ，将细胞悬液接种于９６孔培养板，１００μｌ／孔，每组设５个复孔，并设一个不含细胞的空白调零孔。于３７℃、５％ＣＯ２饱和湿度的恒温培养箱内培养。分别于培养０ｄ、１ｄ、２ｄ、３ｄ和４ｄ后加入５ｍｇ／ｍｌ的ＭＴＴ试剂（Ｓｉｇｍａ公司）１０μｌ／孔，３７℃培养箱孵育４ｈ后去上清，每孔加入１００μｌＤＭＳＯ，避光摇匀１０ｍｉｎ。酶标仪检测４５０ｎｍ波长Ａ值（吸光值）。应用ＳＰＳＳ１３．０统计软件包进行分析，实验数据以均数±标准差（珚ｘ±ｓ）表示，两样本率的比较采用ｘ２检验，Ｐ＜０．０５表示差异具有统计学意义。
２结果
２．１慢病毒干扰载体构建、包装及稳定感染
ＨＯ８９１０细胞连接产物转入制备好的细菌感受态细胞后对长出的单克隆菌落进行测序鉴定。结果表明，重组克隆中插入片段序列与设计的ｏｌｉｇｏ序列完全一致，成功构建目的基因ＲＮＡ干扰慢病毒载体。慢病毒表达载体和包装质粒共转染２９３Ｔ细胞，包装病毒，测定滴度为１×１０９ＴＵ／ｍｌ。ＬＡＩＲ－１－ｓｈＲＮＡ慢病毒颗粒和空白对照病毒颗粒分别感染ＨＯ８９１０细胞，９６ｈ后荧光显微镜检查发现，ＮＣ组（图１Ａ）和ＫＤ组（图１Ｂ）细胞内均见绿荧光表达，表明本研究采用的慢病毒载体系统可高效感染ＨＯ８９１０细胞。
２．２ｓｈＲＮＡ沉默效率检测
ｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ检测
ＬＡＩＲ－１ｍＲＮＡ的表达水平，结果显示ＬＡＩＲ－１－ｓｈＲＮＡ能够有效沉默ＬＡＩＲ－１分子在ＨＯ８９１０细胞上的表达，相对于ＮＣ组，ＫＤ组ＬＡＩＲ－１基因敲减效率达到４８．４％，差异具有统计学意义（Ｐ＜０．０５）（图２Ａ）。ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测结果显示ＣＤ３０５－ｓｈＲＮＡ能够高效沉默ＬＡＩＲ－１分子在ＨＯ８９１０细胞上的表达（图２Ｂ）。
２．３下调ＬＡＩＲ－１对ＨＯ８９１０细胞细胞周期的影响
ＰＩ染色，流式细胞术检测分析细胞周期。结果显示，ＬＡＩＲ－１－ｓｈＲＮＡ组Ｇ１期细胞百分率为１５．９２％±１．５５％，明显低于ＨＯ８９１０（３４．５０％±３．０１％）组和ＮＣ－ｓｈＲＮＡＨＯ８９１０（１９．５０％±１．０３％）组，差异具有统计学意义（Ｐ＜０．０５）（图３）。该结果表明ＬＡＩＲ－１可以抑制Ｇ１期细胞进入分裂期。２．４下调ＬＡＩＲ－１对ＨＯ８９１０细胞增殖能力的影响分别收集生长状态良好的ＨＯ８９１０、ＮＣ－ｓｈＲＮＡＨＯ８９１０和ＬＡＩＲ－１－ｓｈＲＮＡ组细胞。采用ＭＴＴ法检测沉默ＬＡＩＲ－１对ＨＯ８９１０增殖能力的影响。结果显示，ＬＡＩＲ－１－ｓｈＲＮＡＨＯ８９１０组细胞的增殖率明显高于ＮＣ－ｓｈＲＮＡＨＯ８９１０组和未转染ＨＯ８９１０细胞组，差异具有统计学意义（Ｐ＜０．０５）（图４）。由此可见，沉默ＬＡＩＲ－１表达明显促进细胞增殖。
３讨论
ＯＣ是一种由多种不同病理组织学类型所组成的异质性疾病，其生物学和临床病理特征呈现较大差异。卵巢癌深居盆腔，早期临床症状不明显，多数病人在明确诊断时已处于癌症晚期［４］。患者易耐药、易复发、预后差，死亡率极高。近些年来发现的卵巢癌原发病灶标记分子，如肿瘤干细胞分子标记物ＣＤ１１７、ＣＤ４４、ＣＤ１３３［５－７］以及参与ＤＮＡ修复的分子ＥＲＣＣ１、ＢＲＣＡ１／２等［８－９］为临床工作提供了一定的指导意义，特别是这些分子表达差异与化疗耐药性的相关性。然而由于可重复性差、特异性和敏感性低等原因，一直未被临床广泛使用。此外研究发现，较目前临床应用最广泛的肿瘤分子标记物ＣＡ１２５，人附睾蛋白４（ＨＥ４）特异性更高，然而ＨＥ４在ＯＣ治疗监测方面的临床应用价值仍待深入研究［１０－１１］。因此探寻新的卵巢癌相关肿瘤标记物，并深入研究其与卵巢癌致病机理相关的相关性，可为肿瘤的诊断和治疗提供新的视角。抑制性受体作为一类跨膜糖蛋白，能抑制或阻断由细胞外到细胞内的信号传递，最终导致诱导信号的终止。目前已发现的抑制性受体已超过３０种［１２－１４］，从结构上可以将它们分为两类：一类是属于ＩｇＳＦ的Ⅰ型跨膜糖蛋白，主要包括ＰＤ－１、ＫＩＲ、ＬＡＩＲ－１等；第二类属于ＣＬＳＦ的Ⅱ型跨膜糖蛋白，主要包括Ｌｙ４９家族、ＮＫＧ２家族、ＣＤ９４等。天然免疫和适应性免疫有效地利用抑制性受体并产生一定的反应，有效维持机体的免疫耐受和免疫自稳，防止自身病理反应的发生。对免疫抑制性受体的结构、分布和生物学功能的深入研究，可为人类抗肿瘤反应、抗病毒免疫和自身免疫性疾病的发生提供新思想和新策略，并为理解并阐明其在机体免疫病理和免疫耐受中的作用奠定基础。ＬＡＩＲ－１是主要表达于造血细胞并对造血细胞的功能发挥负调控作用的一种免疫抑制性受体家族的成员［１５］。其表达比目前已经鉴定的其他抑制性受体具有更广泛的分布。国内已有研究者发现，肿瘤细胞也表达ＬＡＩＲ－１，这与前期报道不同［１６］。以往研究结果显示，高表达于免疫细胞的多种抑制性受体家族成员参与肿瘤的免疫逃逸。已发现免疫抑制性受体ＰＤ－１和ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ可通过与其配体相互作用而减弱由Ｔ细胞介导的抗肿瘤免疫应答［１７－１９］，阻断抑制性受体ＰＤ－１及ＣＴＬＡ－４与其配体的结合能够显著增强Ｔ细胞介导的抗肿瘤免疫应答［１８］。虽然已证实免疫抑制性受体在肿瘤免疫中发挥重要作用，但关于ＬＡＩＲ－１表达于非造血细胞和肿瘤细胞的报道少见，其作用机制尚未完全明确。我们最近的研究结果显示，白细胞相关免疫球蛋白样受体１（ＬＡＩＲ－１）表达于卵巢癌细胞，但不表达于正常卵巢组织。基于上述研究资料，为进一步研究卵巢癌细胞表达的ＬＡＩＲ－１对肿瘤细胞生物学活性的影响，我们采用慢病毒ｓｈＲＮＡ干扰沉默技术建立了沉默ＬＡＩＲ－１表达的卵巢癌细胞株ＬＡＩＲ－１－ｓｈＲＮＡＨＯ８９１０。进而研究下调ＬＡＩＲ－１表达对ＨＯ８９１０细胞周期及增殖能力的影响。细胞周期检测结果显示，ＬＡＩＲ－１－ｓｈＲＮＡ组Ｇ１期细胞百分率为明显低于ＨＯ８９１０细胞组和ＮＣ－ｓｈＲ－ＮＡＨＯ８９１０组细胞（Ｐ＜０．０５）。增殖实验结果显示，ＬＡＩＲ－１－ｓｈＲＮＡＨＯ８９１０组细胞的增殖率明显高于阴性对照ＮＣ－ｓｈＲＮＡＨＯ８９１０组和未转染ＨＯ８９１０细胞组（Ｐ＜０．０５）。上述实验结果提示，ＬＡＩＲ－１可通过抑制Ｇ１期细胞进入分裂期而发挥对肿瘤细胞增殖产生抑制作用。综上所述，卵巢癌细胞表达的ＬＡＩＲ－１分子对肿瘤细胞的增殖发挥抑制作用。该研究结果为下一步深入探讨ＬＡＩＲ－１与卵巢癌发生、发展的相关机制奠定基础。ＬＡＩＲ－１分子对肿瘤细胞其他生物学功能的影响及作用机制的阐明有待后续实验的进一步研机电期刊究。山东职称
作者：何晓丽 付爱丽 曹奇志 于文征 薛江楠 单位：滨州医学院免疫学教研室 中国人民解放军第１０７医院检验科