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摘要:为了对辽宁省近年发生的新病害———榛子叶斑病病原菌的生物学特性进行系统测定。采用已经鉴定并报道的榛子叶斑病致病菌榛叶点霉(Phyllostictacoryli)菌株分别置于设定条件下,采用十字交叉法测量菌落直径,分别测定该病原菌菌丝及分生孢子的生物学特性,对该病害的症状及病原菌形态进行描述,并对病菌的生物学特性进行系统测定。病菌菌丝生长以PSA培养基最适,能有效利用多种糖和氮源,分别以麦芽糖和甘氨酸最佳,菌丝适宜生长温度为20~25℃,最适pH值为7~9,光照可促进菌丝生长,菌丝致死温度61℃。病菌分生孢子萌发适宜温度为15~25℃,最适pH值为5,黑暗条件下对孢子更易萌发,分生孢子致死温度58℃。对病原菌菌丝和分生孢子的生物学特性系统测定结果表明,不同培养条件下,病原菌菌丝生长和分生孢子萌发均表现出明显的差异。
关键词:榛子;叶斑病;榛叶点霉;菌落直径;生长温度;生物学特性
榛子(CorylusheterophllaFischl)为榛科榛属木本植物的球果,别称平榛、榛、棰子等。榛子为坚果,果形似栗子,红棕色或金黄褐色,并着彩色条纹[1],广泛分布于东北、华北及陕西、甘肃等地。榛子有“坚果之王”的美称,与扁桃、胡桃、腰果并称“四大坚果”。其坚果营养丰富,用途广泛,经济价值高,是加工各种巧克力、糖果、冰淇淋以及榛子粉和榛子乳等高级营养品的重要原料[2],还具有消炎、防心血管疾病、增强性功能、养颜护肤、延年益寿和抗衰老的功效[3]。而随着榛子的营养价值和药用价值逐渐被人们重视,种植面积快速增加,随之而来是病害的发生严重。2011年8月,笔者在辽宁省瓦房店市炮台镇首次发现榛子叶斑病,随后在辽宁省抚顺章党基地也发现该病的发生。榛子叶斑病由叶点霉属(Phyllosticta)真菌引起。Saccardo于1884年首次对榛子叶斑病进行记载,病原菌为榛叶点霉(Phyllostictacoryli)[4]。笔者曾对中国辽宁省新见发生的榛子叶部病害进行初步研究,并经柯赫氏法则证病,结合分离菌株的ITS序列分析,鉴定其致病菌为榛叶点霉,认为该病害为榛子叶斑病并对其进行了相关报道[5]。园地调查发现,在榛子结果期,高温高湿条件下的榛子叶斑病的发生率显著增加。近年来,病害发生面积呈扩展趋势。榛子叶斑病菌主要危害榛子的叶片,初期在叶片正反两面均产生针尖大小的褐色斑点,随后病斑逐渐扩大,病斑直径3~9mm,病斑边缘颜色较中间颜色稍浅。严重时叶片干枯脱落,影响产量。湿度大时,病斑上生有小黑点,即为病菌的分生孢子器(图1-A)。利用病菌孢悬液接种榛子叶片后,室温保湿,8~10d叶片开始表现症状,叶面出现针尖大小褪绿斑,后扩展至圆形至椭圆形褐色病斑(图1-B),表现症状与园地症状一致。在PDA培养基中培养10d左右,菌落呈灰白色,气生菌丝短而致密;随着培养时间的不断加长,菌落颜色逐渐变深,呈灰黑色,在菌落上产生分生孢子器。分生孢子器球形,深褐色,直径150~205m(图2-A)。分生孢子单胞,无色,卵圆形至椭圆形,大小在(2.4~4.5)m×(1.6~2.4)m(图2-B)。本研究针对榛子叶斑病致病菌的生物学特性进行了较为系统的测定,以便进一步为该病害的深入研究提供理论依据。
1材料与方法
1.1病菌菌丝生长测定将纯化的菌株进行活化,在试验设定条件下接种病菌单孢子,25℃恒温培养,10d后采用十字交叉法测量菌落直径。每处理5次重复[6]。1.1.1培养基试验选用PDA、PSA、OA、玉米粉培养基、水琼脂培养基、Rechard、Czapek和孟加拉红培养基。1.1.2碳源试验供试碳源为木糖、可溶性淀粉、麦芽糖、葡萄糖、果糖、甘露醇、乳糖、山梨醇,PDA为基础培养基,不同碳源等量置换葡萄糖[7]。1.1.3氮源试验供试氮源分别选用蛋白胨、丙氨酸、胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、精氨酸、甲硫氨酸,查氏为基础培养基,不同氮源等量置换KNO3。1.1.4温度试验用PDA培养基,分别置于5、10、15、20、25、30、35℃不同温度下恒温培养。1.1.5pH值试验用1mol/LHCl和1mol/LNaOH将PDA培养基pH值分别调节为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0。1.1.6光照试验采用PDA平板培养基,分别置于24h/d光照条件、12h光照与12h黑暗交替、24h黑暗条件下培养。1.2菌丝致死温度试验将直径为4mm的菌片移入装有10mL无菌水的试管中,再将试管分别置于40~80℃(梯度为5℃)9个处理温度的恒温水浴锅中处理10min(预热1min),测得致死温度范围后,以1℃为梯度求得准确的致死温度。试验重复处理5次。1.3分生孢子萌发测定每处理重复5次,培养24h后每次随机镜检100个孢子,统计萌发率[6]。1.3.1温度对分生孢子萌发的影响经预备试验后,选用孢子清水萌发法,将分生孢子配成浓度适当的悬浮液,滴于载玻片上,分别置于5、10、15、20、25、30、35℃条件下培养。1.3.2pH值对分生孢子萌发的影响用磷酸盐缓冲液将分生孢子悬浮液pH值调配为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0,25℃恒温培养。1.3.3光照对分生孢子萌发的影响将分生孢子悬浮液滴在载玻片上,分别置于光照、光照与黑暗交替、黑暗条件下,25℃恒温培养。1.4分生孢子致死温度测定清水配制孢悬液,装入试管中,置于35~60℃(梯度为5℃)恒温水浴锅中处理10min(预热1min),测得致死温度范围后,以1℃为梯度求得准确的致死温度。
2结果与分析
2.1环境条件对病菌菌丝生长的影响2.1.1培养基对菌丝生长的影响病菌菌丝在PSA培养基中生长最快,其次为PDA培养基;在Rechard培养基中生长速度最慢(表1)。从菌落形态和颜色看,病菌在水琼脂中稀疏且菌落呈薄透明状,在其他各培养基中均生长致密,在OA培养基、玉米粉培养基、PDA、PSA中菌落呈局部放射状沟痕。2.1.2碳源对菌丝生长的影响病原菌可利用多种糖,在以麦芽糖为碳源的培养基上菌丝生长最快,在以木糖为碳源的培养基上生长最慢(表2)。2.1.3氮源对菌丝生长的影响病菌在不同氮源中生长差异显著,其中尤以甘氨酸、蛋白胨最适合菌丝生长,在含精氨酸的培养基上菌丝几乎不生长(表3)。2.1.4温度对菌丝生长的影响温度对病菌生长影响明显,菌丝在5~35℃范围内均能扩展,20~25℃为最适宜温度。低于5℃或高于35℃均不利于病菌菌丝生长(图3)2.1.5pH值对菌丝生长的影响菌丝生长的pH值范围为3~11,pH值3~4范围内,随pH值增高菌丝生长速度明显加快;pH值7~9时,菌落生长速度最快,为该菌最适宜生长的pH值。可见,偏碱性条件有利于菌丝生长(图4)。2.1.6光照对菌丝生长的影响菌丝在光照条件、光暗交替条件下菌落直径分别为6.50、6.45cm显著高于黑暗条件下的4.77cm。说明不同光照处理对菌丝生长的影响存在一定差异,光照条件更有利于菌丝生长。2.1.7菌丝致死温度当处理温度达61℃后,无菌丝生长,表明该菌菌丝致死温度为61℃。2.2环境条件对分生孢子萌发的影响2.2.1温度对孢子萌发的影响从图5可以看出,温度对分生孢子萌发的影响较大,15~25℃为萌发最适温度,24h萌发率接近80%,低于10℃或高于30℃严重抑制分生孢子的萌发。2.2.2pH值对孢子萌发的影响病菌分生孢子萌发的pH值范围为3~11,最适pH值为5。pH值3、11时,病菌分生孢子萌发率极低(图6)。2.2.3光照对孢子萌发的影响黑暗条件下孢子萌发率为71.67%,明显高于光照条件下的35.46%和光暗交替条件下的53.07%,可见黑暗条件促进孢子萌发。2.2.4分生孢子致死温度测定病菌的分生孢子经≥58℃的几个温度处理后,均不萌发,表明该菌分生孢子的致死温度为58℃。
3讨论
Saccardo于1884年首次对榛子叶斑病进行记载,确定其2.1.5pH值对菌丝生长的影响菌丝生长的pH值范围为3~11,pH值3~4范围内,随pH值增高菌丝生长速度明显加快;pH值7~9时,菌落生长速度最快,为该菌最适宜生长的pH值。可见,偏碱性条件有利于菌丝生长(图4)。2.1.6光照对菌丝生长的影响菌丝在光照条件、光暗交替条件下菌落直径分别为6.50、6.45cm显著高于黑暗条件下的4.77cm。说明不同光照处理对菌丝生长的影响存在一定差异,光照条件更有利于菌丝生长。2.1.7菌丝致死温度当处理温度达61℃后,无菌丝生长,表明该菌菌丝致死温度为61℃。2.2环境条件对分生孢子萌发的影响2.2.1温度对孢子萌发的影响从图5可以看出,温度对分生孢子萌发的影响较大,15~25℃为萌发最适温度,24h萌发率接近80%,低于10℃或高于30℃严重抑制分生孢子的萌发。2.2.2pH值对孢子萌发的影响病菌分生孢子萌发的pH值范围为3~11,最适pH值为5。pH值3、11时,病菌分生孢子萌发率极低(图6)。2.2.3光照对孢子萌发的影响黑暗条件下孢子萌发率为71.67%,明显高于光照条件下的35.46%和光暗交替条件下的53.07%,可见黑暗条件促进孢子萌发。2.2.4分生孢子致死温度测定病菌的分生孢子经≥58℃的几个温度处理后,均不萌发,表明该菌分生孢子的致死温度为58℃。
参考文献:
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作者:孙俊 单位:辽宁省经济林研究所