1生物学活性代谢产物提取
取发酵液，以4℃、4000r/min离心30min去除菌丝，再用0.45um水溶性滤膜滤去残余菌体，滤液用30kD超滤管以4℃、5500r/min超滤20min，用少量PBS溶液将蛋白洗脱，上层洗脱液（大分子物质）和下层超滤液（小分子）分别保藏待用。下层超滤液用乙酸乙酯等体积萃取（萃取2次，每次用原溶液1/2体积的乙酸乙酯萃取，再合并），45℃旋转浓缩至1/10体积。生物学活性代谢产物的活性分析将1.2.4节上层洗脱液和下层超滤液分别对供试菌株B5和B3进行牛津杯生物学实验，每个处理重复3次。每支试管添加15mL牛肉膏液体培养基并灭菌，冷却后分别添加上述粗提取的下层超滤浓缩液2mL，混合后接种供试菌株B5，以35℃、120r/min摇床培养，分别于0h，4h、8h、12h、16h和20h，6个时间点测定培养液的吸光度，每个样重复处理3个，取平均值。生物学活性代谢产物判定取1.2.5节实验中具有生物学活性的液体，进行双缩脲蛋白显色实验，取3mL液体，加入0.1g/mLNaOH溶液3mL，震荡均匀，再加入2~3滴0.01g/mLCuSO4，震荡摇匀，观察是否出现紫红色，判断具有抑菌活性的代谢产物中是否有蛋白质，是否为活性蛋白抑菌生物学活性性质。
2结果与分析
2.1生物学活性菌株的筛选
牛津杯实验结果显示，30株放线菌中有2株对供试菌株具有明显的抑菌活性，编号分别为A22、A2，抑菌效果如图1所示。图1结果表明，A22和A2的牛津杯实验抑菌圈很明显，A22抑菌圈内径为6mm，外径为18mm；A2抑菌圈内径为6mm，外径为12mm。比较结果表明，A22和A2对供试菌株均具有生物学抑菌效果，且A22较强。重复实验结果也表明这两株放线菌对供试菌株的生物学抑菌效果比较稳定。
2.2菌株的形态观察
按实验方法对A22、A2进行形态学观察[25]，菌落及电镜照片分别见图2和图3。培养过程的观察结果表明，A22和A2的生长周期相似，都在72h左右长出成熟菌落，A22形成白色、边缘整齐凸起的圆形菌落；A2的菌落呈圆形，菌落呈灰色，边缘整齐无凸起，气丝呈粉状。A22在5d生成褐色色素，A2的色素形成稍晚在7d左右生成，并且在菌落形成后期可以闻到明显的土腥味，以上基本特征符合放线菌的生理特征，可以初步确定此两株菌均为放线菌。
2.3菌株的分子鉴定
对菌株A22、A2的基因组DNA进行提取，A22的PCR产物测序长度为1500bp，A2的PCR产物测序长度为1400bp，再利用BLAST将所测定株菌株的序列与GenBank/EMBL/DDBJ数据库中已知放线菌的16SrRNA序列进行比较鉴定。结果表明，A22菌株与白色链霉菌（Streptomycesalbus）、A2菌株与灰色链霉菌（Streptomycesgriseus）同源性最高，且同源性均可达到99%以上。再将序列经ClustalX多序列比对后，利用Neighbour-joining方法构建系统发育树，结果见图3。由图3可知，A2、A22分别与Streptomycesgriseus的模式菌株JX007982、Streptomycesalbus的模式菌株NRRLB-2365相似度最近，同源性最高，可确定A2、A22分别为Streptomycessp.的Streptomycesgriseus和Streptomycesalbus。
2.4菌株代谢产物活性分析
牛津杯实验结果表明，A22与A2的上层洗脱液没有生物学抑菌活性，下层超滤液的抑菌活性则非常明显，并且同一株菌的下层滤液，由于发酵时间不同和作用的供试菌株不同，呈现出的生物学活性效果也不同。牛津杯实验结果见图4-图6（图下为1.2.3培养时间）。如图5~图7所示，A22与A2在发酵30-36h的发酵代谢产物对供试菌株的生物学抑菌活性最强，对比图5与图6，A22对B5的生物学抑菌活性相对B3较强，而A2只对B5表现出了抑菌活性，总体上A22比A2对供试菌株的生物学抑菌效果更好。对比图5和图7，A22比A2的代谢产物对供试菌株具有更加稳定的抑菌生物学关系，抑菌生物学效果更强。为进一步分析A22和A2代谢产物的生物学活性效果，选用B5作为供试菌株，添加A22和A2代谢产物进行液体培养，测定发酵菌液的吸光度值，从生物量上比较A22和A2代谢产物对供试菌株的生物学活性，结果见表1、表2。6培养时间（h）菌株及发酵时间A22(24h)A22(30h)A22(36h)A22(42h)A22(48h)A22(54h)000000040.0370.0160.0090.0300.0350.04280.0460.0310.0160.0410.0390.053120.0560.0350.0350.0520.0650.068160.0620.0380.0660.0890.1030.113200.0910.0500.0730.1540.1940.176表2A2发酵液下层超滤液-B5液体培养吸光度分析结果培养时间（h）菌株及发酵时间A2(24h)A2(30h)A2(36h)A2(42h)A2(48h)A2(54h)000000040.0250.0150.0170.0280.0190.02380.0430.0220.030.0420.0360.031120.0470.0420.0530.0460.0620.062160.0850.0670.070.0780.0730.075200.1200.0790.0830.1330.0960.150表1、表2结果表明，A22和A2在30-36h发酵时间段发酵液超滤的下层超滤液对供试菌株的生物学抑菌活性最强，因为添加30-36h时段发酵液超滤后下层超滤液的B5培养液中菌体的吸光度值是最小，表明此时的B5菌体生长受到抑制，菌浓较低。在添加了发酵时间36h后的发酵液超滤下层超滤液的B5培养液中，菌体的吸光度值又变大，菌浓较大，这说明发酵36h后，积累的代谢生物学抑菌活性成分被降解或利用掉了，生物学抑菌活性成分浓度降低或没有生物学抑菌活性成分。表1、表2结果还表明，A22在发酵30h的代谢产物生物学活性效果最为显著。液态发酵生物学结果与牛津杯实验中图5、图7的结果也吻合。因此，可知A22的代谢产物对供试菌株的生物学抑菌活性效果要比A2强，A22在发酵30h时代谢积累的对供试菌株具有生物学抑菌活性的代谢产物浓度也大。
2.5生物学抑菌活性代谢产物分析
根据双缩脲实验结果，A22和A2发酵代谢对供试菌株具有生物学抑菌活性的代谢产物与双缩脲试剂均匀混合后只呈现出淡蓝色，而并未呈现出紫色，表明并未生成紫色络合物，再结合超滤管下层滤液分子量较小的特性，可以断定对供试菌株具有生物学抑菌活性的代谢产物并非蛋白质[26]，可能为某种抗生素类的小分子化合物。相对芽孢杆菌对白酒风味影响的研究[27-28]，放线菌在白酒酿造过程的作用并未引起太多关注，黄兵证明了放线菌与芽孢杆菌间存在互相的生长影响关系[29]，这同本实验得出放线菌代谢产物对产酱香芽孢杆菌存在生物学抑制活性作用的结论相似，说明放线菌能通过对产酱香芽孢杆菌的生物学调控来影响产香菌的生长和代谢积累白酒风味成分。另外，对比其他领域的放线菌生物学抑菌研究，相似体积与浓缩浓度下本实验所观察到的放线菌代谢产物抑菌圈较小[30-31]，抑菌作用柔和，说明放线菌对白酒酿造微生态存在并不是单纯的破坏，而是对其进行合理的调控，这也与本实验的研究初衷相吻合。固态发酵过程存在生物学调控、酶化学调控、工艺条件调控、环境基态和物态调控等，其中最核心的调控为生物学调控和物态调控，生物学调控中尤其是功能型群体微生物的调控[32]。关于放线菌对固态发酵过程功能性微生物群落的整体性生物学调控和风味调控机理目前本课题组正在进一步深入研究。
3结论
从30株放线菌筛出2株具有生物学抑菌活性的放线菌A22和A2，对其代谢产物对产酱香芽孢杆菌供试菌B5、B3的生物学调控效果行研究。结果显示，A22比A2的生物学抑菌效果好；放线菌A22、A2在28℃、120r/min液体发酵培养30-36h时代谢产物的生物学抑菌效果最显著，初步判眼科医学论文断生物学活性抑菌代谢产物为非蛋白质化合物。
作者：尤小龙 黄润莉 黄永光 周文美 单位：贵州大学白酒与食品工程学院 贵州省轻工业科学研究所