1材料与方法
(1)L929细胞系(ATCC)，MEM细胞培养基，3－(4，5－二甲基噻唑－2)－2，5－二苯基四氮唑溴盐(简称MTT)。(2)取100μL浓度为1×104/mL，1.5×104/mL，2×104/mL，5×104/mL，8×104/mL，1×105/mL，2×105/mL的L929细胞分别接种于96微孔板中，相当于每孔分别接种细胞数约1×103，1.5×103，2×103，5×103，8×103，1×104，2×104，培养4h～120h，每24h以MTT掺入的方式监测细胞增殖情况并绘制生长曲线。(3)同一被检物分别应用GB/T14233.2－2005及ISO10993－5:2009给出的MTT试验方法检测其细胞毒性。
2结果与讨论
2.1不同起始细胞密度L929细胞生长曲线测定
当接种浓度较低为1×104/mL，1.5×104/mL，2×104/mL时，L929细胞在72h之前都处于增殖缓慢状态;在8×104/mL，1×105/mL两个个浓度下，细胞在生长24h后进入对数生长期，并在72～96h进入平台期;2×105/mL浓度组细胞贴壁后即进入对数生长期，48h起即进入平台期。如表1，不同起始接种浓度L929细胞随培养时间生长增殖情况，以酶标仪570nm与630nm测定吸光度差值表示;图1直观显示了细胞生长曲线。细胞生长进入对数生长期之前，对生长环境的变化反应较敏感，因此为排除细胞本身生长带来的干扰，细胞毒性试验应选择处于对数生长期阶段给予刺激物，以真实反应待检物对细胞生长的抑制程度，这一点在2009版国际标准中特别进行了强调。
2.2同一被检物细胞毒性试验
选取一高分子材料分别应用GB/T14233.2－2005及ISO10993－5:2009给出的MTT试验方法检测其细胞毒性，结果如下:(1)GB/T14233.2－2005中8.5.6a)方法:L929初始接种浓度为1×104/mL，生长24h后加入待检物浸提液，培养72h，细胞相对增殖率为15.9%，可判为有毒性。(2)ISO10993－5:2009附录c方法:L929初始接种浓度为1×105/mL，生长24h后加入待检物浸提液，培养24h，细胞相对增殖率为94.3%，可判为无毒性。同一待检物以不同MTT试验方法得到完全不同的细胞毒性结果，对需做出依据试验结果做出合格判断的机构来说会带来很大困惑。从图1生长曲线可以看出GB/T14233.2－2005方法要求接种细胞的初始浓度较小，细胞在生长24h后还未进入对数生长期，对任何因素的变化都会有较敏感的反应，可能会放大待检物微小的细胞抑制作用;而在ISO10993－5:2009方法中，细胞初始接种量是GB/T14233.2－2005的10倍，24h后细胞已进入对数生长期，可较客观地反应待检物对细胞生长的影响。根据细胞生长曲线，还有一个需要特别注意的问题:“加入待检物后，细胞还应培养多久?是不是越久越能反应出待检物的毒性?”2009版国际标准规定:在待检物作用24h后细胞读取结果，这时候对照组细胞仍应处于对数生长期，实验组与处于对数生长期的对照组相比较得到其真实增殖率;如果待检物加入后培养48h或更长时间，从图1可以看到，这时候对照组已开始进入平台期，进入平台期后细胞的增殖会受到抑制并开始凋亡，而当待检物对细胞只有抑制作用而非杀伤作用时，实验组细胞生长达到平台期的时间会延后，经过较长时间的培养后，实验组细胞的增殖程度可能反而会赶上或超过对照组，当计算相对增殖率时会得到假阴性结果，也就是说有时延长培养时间反而不能反映出待检物的细胞毒性。综上，MTT试验的标准操作规程(SOP)需明确规定合理的细胞初始接种量及待检物加入后的培养时间，不能在SOP中出现弹性的要求，如“加入待检物后培养时间不小于24h”，或“培养24～72h”;当细胞相对增殖率超过100%时，要特别密切关注试验的原始吸光值，分析结果是否合理;如应用编好的程序直接读取细胞相对增殖率，不记录原始吸光值度，则会产生较大风险。
3结论
应依据所应用细胞系生长特性，选择MTT法细胞毒性试验条件，并应标准化，随意改变试验条件会得到不同的试验结果，不利于对医疗器械细胞毒性进行客观、科学的评价。
作者：贺学英 王蕊 王会如 单位：北京市医疗器械检验所
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