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组织型转谷氨酰胺酶对乳腺癌的作用

时间:2017-02-06 23:08:49 来源:论文投稿

TG2和MMP-9及Vim-entin蛋白表达检测转染72h后,采用蛋白质印迹检测TG2、MMP-9和Vimentin蛋白的表达。常规方法提取MDA-MB-231细胞蛋白样品,行SDS-PAGE凝胶配制和电泳,选用PVDF膜转膜,用50g/L脱脂奶粉封闭2h后。一抗室温2h,4℃过夜孵育,第2天再室温1h;二抗室温2h孵育。ECL化学发光,显影,定影后图像分析仪扫描,ImageJ软件分析条带灰度值。

1标本来源

收集2012-05-10-2014-07-29广西医科大学第一附属医院(46例)和江西省肿瘤医院(35例)手术切除的乳腺浸润性导管癌患者81例,均经病理确诊。癌旁组织距肿瘤边缘>2cm的无癌组织,并经病理检测证实。患者均为女性,年龄35~60岁,中位年龄48岁。原发肿瘤直径1.5cm~5.0cm,腋窝淋巴结转移数目≤3枚,无远处转移(患者受检淋巴结数目均>10枚)。所有患者术前均未接受过放疗和化疗。经医院伦理委员会批准,对患者癌组织和癌旁组织行免疫组化检测TG2和MMP-9及Vimentin蛋白表达水平。实验步骤按说明书(PV二步法免疫组化检测试剂盒)进行,各蛋白所有标本在相同条件下检测,相同病理科医生评分。1.6结果判定标准TG2、MMP-9和Vimentin染色阳性判断标准以肿瘤细胞的胞质内出现棕黄色染色为阳性。在显微镜下随机选择5个高倍(×400)视野,每个视野计数100个细胞,结果根据肿瘤细胞着色比例,分为4级:无着色为阴性(-),阳性细胞比例<25%为弱阳性(+),阳性细胞比例25%~50%为中度阳性(++),阳性细胞比例>50%为强阳性(+++)。考虑到肿瘤细胞Vimentin阳性染色数目相对较少,肿瘤细胞中只要出现阳性染色则判断为阳性[3]。1.7统计学方法采用SPSS16.0统计细胞实验部分计量资料采用x-±s表示,各组比较用方差分析或非参数检验。临床免疫组化测定资料,两样本率的检验采用χ2检验或Fisher精确检验法,采用Spearman进行相关分析。检验水准α=0.05。

2结果

2.1TGM2mRNA表达

TGM2shRNA转染MDA-MB-231细胞96h后,TGM2shRNA表达结果显示,Con组TGM2mR-NA表达量为1,RNAi组TGM2mRNA表达量为0.21±0.03,明显低于Con组,z=-2.087,P=0.0369;明显低于NC组的0.94±0.05,z=-1.964,P=0.0495。表明TGM2shRNA能有效抑制TGM2mRNA的表达。

2.2Transwell肿瘤细胞侵袭和迁移实验

侵袭到滤膜下的细胞数RNAi组为42.33±4.04,低于Con组(93.50±7.42)和NC组(87.25±5.74),z值均=-2.121,P值均=0.0339。迁移到滤膜下的细胞数RNAi组为66.13±4.59,低于Con组(116.75±7.82)和NC组(109.00±7.79),z值均=-2.309,P值均=0.0209。

2.3TG2和Vimentin及MMP-9蛋白的表达

蛋白质印迹检测结果如图1显示,RNAi组、NC组和Con组TG2蛋白相对表达量分别为0.34±0.06、0.87±0.10和0.95±0.03。Levene方差齐性检验,F=2.92,P=0.13;3组均数差异有统计学意义,F=66.55,P<0.001。LSD检验,RNAi组低于Con组和NC组,P值均<0.001。RNAi组Vimentin蛋白相对表达量为0.45±0.05,低于NC组的0.89±0.07和Con组的0.90±0.03。Levene方差齐性检验,F=1.16,P=0.38;3组均数差异有统计学意义,F=80.56,P<0.001。LSD检验,RNAi组低于Con组和NC组,P值均<0.001。RNAi组、NC组和Con组MMP-9蛋白相对表达量分别为0.09±0.02、0.18±0.03和0.19±0.04。Levene方差齐性检验,F=0.34,P=0.73;3组均数差异有统计学意义,F=12.89,P=0.007。LSD检验,RNAi组低于NC组(P=0.007)和Con组(P=0.003)。与非参数法检验结果相同。

2.4TG2表达水平与乳腺癌淋巴结转移关系

图2所示,TG2表达主要位于细胞质和胞膜;Vi-mentin表达主要位于间质中,在少数癌细胞也出现表达;MMP-9表达主要位于细胞质。表1所示,TG2的表达水平与年龄、肿瘤分化程度和月经状态无显著相关性,而与淋巴结转移、ER表达水平和TNM分期相关。淋巴结转移组乳腺癌组织中TG2阳性表达率为75.0%,而在淋巴结未转移组中TG2阳性表达率为32.4%,差异有统计学意义,χ2=14.75,P<0.001。

2.5TG2与Vimentin及MMP-9表达相关性

Spearman相关分析如表2所示,TG2与Vimen-tin表示水平呈正相关,r=0.337,P=0.002;与MMP-9表达水平呈正相关,r=0.358,P=0.001。

3讨论

上皮-间质转化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)和细胞外基质与肿瘤侵袭转移密切相关[4]。本研究推测,TG2可能与EMT和细胞外基质存在内在联系。Vimentin是上皮间质转化过程中重要的生物标志[5]。MMP-9是蛋白水解酶重要成员,能降解细胞外基质,增加细胞的运动能力,与肿瘤侵袭和转移密切相关[6]。因此本研究通过检测Vimentin和MMP-9表达水平,探讨TG2表达水平与侵袭转移的关系。

作者:贺文兴 黄传生 全军利 吴斯明 李健林 刘志明 单位:广西医科大学第一附属医院普通外科 江西省肿瘤医院病理科


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